CAST,一种高效的基因敲入技术190605

技术背景:CRISPR敲入效率低
当前,CRISPR技术主要用于基因敲除,在特定的场合下,一些外源基因或DNA片段也需要插入到不同生物体的基因组中特定的位置,虽然CRISPR也能实现基因组定点插入或整合,但是敲入效率远远低于基因敲除的效率。主要是利用Cas9酶类蛋白切开基因组上的DNA链,然后利用宿主的DNA修复系统来实现外源DNA片段的整合。但是,这严重依赖宿主的效率有限的DNA修复系统,从而导致基因敲入整体效率不高。

技术优化
MIT张锋团队在NIH的Eugene Koonin教授所在团队的研究基础上,与其合作开发了一种全新的基因敲入技术,在原核生物大肠杆菌中实现了基因整合效率高达80%,称之为CRISPR相关的转座酶系统(CAST),该进展被发表在Science在线杂志上。https://science.sciencemag.org/content/early/2019/06/05/science.aax9181?rss=1

技术原理
研发团队借助转座子插入外源DNA达到优化CRISPR敲入效率的问题。他们将Cas9切刻酶(D10A)偶联到单链DNA转座酶TnpA上,然后在大肠杆菌基因组中检测到了这种蛋白复合物能够促进外源DNA的定点整合,这说明利用转座子可以实现基因敲入,虽然单链DNA模板的制备和体内递送还存在问题。
研究者利用两种蓝藻中的相关基因分别构建了ShCAST和AcCAST两种CAST系统,每个系统均包含3个质粒,其中pHelper质粒包含转座相关的4个CAST基因(tnsB, tnsC, tniQ和Cas12k)。分别测试了不同CAST基因和不同长度的tracrRNA对CAST系统的活性的影响。结果发现4种CAST基因对于外源基因整合是必需的,同时216 bp的tracrRNA足以产生外源基因的整合,并且他们还证实这种基因整合只发生一次,从而避免了多次基因插入。同时,他们还分析了不同长度的DNA插入片段的整合效率,结果500 bp到10 kb均能有效的插入到特定的位点。另外,研究者还优化了与基因整合相关的LE和RE序列,将它们分别缩短到113 bp和155 bp。
为了进一步证实CAST系统的功能,研究者在体外重构了ShCAST系统,分析了shCAST系统的特异性。通过测序,研究者发现外源DNA的整合集中于靶点位置,而那些主要的脱靶位点在整体比例中占比不到1%。这说明shCAST系统对于基因敲入的特异性相当高。因此,考虑到高达80%的基因敲入效率,和低于1%的脱靶效应,ShCAST系统堪称极为优异的基因敲入技术平台。

研发团队
NIH的Eugene Koonin教授对生物体内天然存在的转座子相关的CRISPR-Cas系统进行了深入的研究,并且发现了二者之间存在着密切的联系,尤其是发现了一些类似Tn7转座子相关的迷你型的CRISPR-Cas系统可以促进转座子在基因组上的扩散。MIT张锋团队和Eugene Koonin团队展开了合作,在这类复合型天然系统的基础上,他们开发出了CRISPR相关的转座酶系统(CAST),并且成功的运用于基因敲入。

技术价值
CAST基因敲入系统不是简单的修修补补,而是从头开始设计,并从大自然进化的生物中寻求完整的解决方案,从而突破了原有系统的瓶颈,实现了基因敲入效率的跨越式提升。该系统还有一些瑕疵,比如会将转座子相关元件(LE和RE序列)也整合到基因组中,但这可以通过插入到内含子中消除这些元件的影响。更重要的是,如果这套系统也适用于哺乳动物细胞基因组编辑,将为生物基础理论研究提供巨大的支持,同时也进一步增加了临床治疗遗传性疾病和癌症的希望。

参考阅读
金斯瑞生物微信公众号(GenScriptBiotech)2019年6月10日推送文章

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